一、实验目的

1. 学习色谱柱的制备

2. 掌握用柱色谱分离、提纯化合物的技术

3. 掌握LC-TOF HRMS的基本原理和仪器构造

4. 掌握LC-TOF HRMS仪器的基本操作步骤，初步应用仪器进行常规混合物的分离和检测

5. 利用仪器相关软件进行数据模拟，并运用Dateanalysis软件对实验数据进行处理

二、实验原理

       荧光黄和亚甲基蓝都是染料。荧光黄为橙红色结晶，商品一般是二钠盐，稀的水溶液带有荧光黄色。亚甲基蓝可以含有3-5个结晶水，三水合物是暗绿色结晶，其稀的乙醇溶液为蓝色。在色谱柱中，用氧化铝做固定相，乙醇为洗脱剂，两者由于吸附能力不同，从而得到分离。

       同时，在大型仪器LC-TOF HRMS中，混合样品首先通过高效液相色谱中高效液相柱，在高压流动相的淋洗下，进行相应的样品分离。分离得到的样品溶液在进入到高分辨质谱仪中进行鉴定。

       LC-TOF HRMS采用ESI（电喷雾）作为离子源，将样品溶液在进样针中带上高压电后形成带电液滴，经高温干燥气逆向吹扫，除去大部分溶剂后发生库仑爆炸，形成样品及样品碎片的带电粒子，然后再通过仪器中相应的离子通道进入到飞行管质量分析器，再高压电场环境下，带电粒子根据其质荷比（m/z）的差异，到达检测器的时间和引起的响应也有差别，最后仪器通过检测器采集到的差异化的电信号，在经过一系列转换后得到我们在工作站电脑上直观显示的质谱图和相应的原始质谱数据，同时我们也能够对仪器采集到的原始质谱数据，运用Dateanalysis软件进行相应的质谱数据处理，质谱图的编辑等等，最终给出质谱检测报告。

三、药品和仪器

       药品：中性氧化铝（100-200目）、 95%乙醇、荧光黄、亚甲基蓝、色谱级乙腈、色谱级甲醇、高纯水，邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二异丙酯。

       仪器：玻璃色谱柱，烧杯，样品瓶，微量进样针，LC-TOFHRMS，蠕动泵，C18高效液相色谱柱。

四、实验步骤

       将色谱柱垂直装置，以25 mL锥形瓶作洗脱液的接受器。用镊子取少许脱脂棉放入干净的色谱柱底，用玻璃棒轻轻塞紧，再在脱脂棉上盖一层厚0.5 cm的沙子（洗净干燥过的沙子），关闭活塞。向柱中倒入10 mL 95%乙醇，打开活塞，控制流出速率为1滴/分。此时从柱上端通过一干燥的长颈漏斗，慢慢加入5 g色谱用的中性氧化铝，用木棒或带橡皮塞的玻璃棒轻轻敲打柱身下部，使填装紧密。（色谱住填装紧与否对分离效果很有影响，若各部分松紧不匀，特别是有断层时，则影响分离速率和显色带的均匀，但如果填装时过分敲击，又使流速太慢。）再在上面加一层0.5 cm厚的沙。整个操作过程一直保持上述流速不变。注意不能使液面低于沙子的上层。当溶剂液面刚好流至沙面时，立即加入0.5 mL已配好的含有0.5 mg荧光黄与0.5 mg亚甲基蓝的95%乙醇溶液。当加入的溶液流至近沙时，立即用0.5 mL 95%乙醇洗下管壁的有色物质，如此2-3次，直至洗净为止。然后在色谱柱上装置滴液漏斗，用95%乙醇洗脱，控制洗出速率1滴/分（此时若速率减慢，可将接收器改成小抽滤瓶，安装合适的塞子，接上水泵，少许减压以保持流速）。

       蓝色的亚甲基蓝首先向柱下移动，荧光黄则留在柱上端，当蓝色的色带快洗出时，更换另一个接收器，继续洗脱，至滴出液体近无色为止，再换一接受器，该用水作洗脱剂（此时可加大减压使流速加快）至黄绿色的荧光黄开始滴出，用另一接受器收集至黄绿色全部洗出为止。这样，即分别得到两种染料的溶液。

       同样的平行实验采用LC-TOF HRMS仪器进行分离和鉴定，将配置好的荧光黄和亚甲基蓝的乙醇溶液稀释100倍，然后将样品溶液装置在样品瓶中，放置在高效液相色谱的自动进样盘中，记录好所放置的样品盘序列号，打开LC-TOF HRMS工作站中的Hystar软件，设置相应的液相方法和质谱检测条件，点击开始图标进行采样，同时质谱仪开始采集数据，观测质谱图中的TIC指标，直至出现相应的色谱峰，可根据分离效果调整高效液相色谱的分离方法以获得更好的分离峰型。

       采集的质谱原始数据可通过Dateanalysis软件进行处理，可通过软件的Verify Formula功能查找相应的分子离子峰，并通过Smart Fomula功能对较大的质谱峰进行智能拟合，最后通过设计相应的报告模板，出具相应的检测报告。

       此外，针对没有颜色的的混合样品，LC-TOF HRMS同样可以进行分离和鉴定，按10ppm浓度配制邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二异丙酯的混合溶液（甲醇作为溶剂），重复开始的实验步骤，对邻苯二甲酸酯混合样品进行分离和鉴定，并出具检测报告。

       测试完毕后，需要用溶剂甲醇作为流动相清洗色谱柱，并在关闭液相色谱仪器后清洗质谱仪离子源。做好常规维护后将仪器置于Standby状态，调节相应的雾化气、干燥气流速，调低干燥气温度，以便下次使用。

五、实验注意事项

1. 加入沙子的目的是使加料时不致把吸附剂冲起，影响分离效果。若无沙子，也可用玻璃毛。

2. 为了保持柱子的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的。否则当柱中溶剂或溶液流干时，就会使柱身干裂，影响渗滤和显色的效果。

3. 最好用移液管将欲分离溶液转移至柱中。

4. 如不装置滴液漏斗，也可用每次倒入10mL洗脱剂的方法进行洗脱。

5. 用LC-TOF HRMS测试的样品浓度不可过大，否则容易污染质谱仪中的毛细管和离子通道。

6. LC-TOF HRMS中的干燥气流速和温度需要设置合适的数值，温度太高可能会导致样品分解，碎片离子增多，影响分子离子峰的丰度。

7. 实验中可以打开液相色谱配备的DAD检测器作为辅助手段，结合DAD检测器的结果能更好判断分离出的化合物组分。

六、思考题

1. 柱色谱中为什么极性大的组分要用极性大的溶剂洗脱？

2. 色谱柱中若留有空气或填装不匀，对分离效果有何影响？如何避免？

3. LC-TOF HRMS仪器中为了保证测试数据的准确性，我们一般采用哪种校正液，校正的原理是什么？

4. 如果液相色谱柱的分离效果不好，两峰之间的距离过近，应该如何调节流动相的比例？

5. 和常规的柱色谱分离相比较，LC-TOF HRMS的优点有哪些？

6. LC-TOF HRMS仪器在测试中所得数据可能会有所偏差，有哪些手段可以消除偏差？